Darmmicrobioomonderzoek en monsterhoudbaarheid

De tijd die tussen de afname van een (ontlastings)monster zit en de verwerking in een laboratorium heeft een grote impact op de kwaliteit en betrouwbaarheid van de onderzoeksresultaten. Bijna alle laboratoria werken met het opsturen van fecesmonsters, waarbij verschillende factoren de reistijd flink kunnen laten oplopen.

Waarom zijn feces-monsters voor het darmmicrobioom-onderzoek van NL-Lab langer houdbaar en de resultaten betrouwbaarder?

Hybridisatie (FISH) analysetechniek

Uit onze analyse blijkt dat monsters voor onderzoek gebaseerd op de Fluorescentie in situ Hybridisatie (FISH) analysetechniek (zoals die van NL-Lab) significant langer betrouwbaar blijven en voordeliger te vervoeren zijn dan monsters voor Polymerase Chain Reaction (PCR), Next Generation Sequencing (NGS) en selectieve, microbiologische kweek.
Hoewel er al geruime tijd overeenstemming bestaat over transport en sampling van fecesmonsters [1] blijkt de praktijk weerbarstiger dan de theorie.

Fecesmonsters zijn onderhevig aan biologisch en chemisch verval, daarom moeten ze zo snel mogelijk worden geanalyseerd [2]. Toch zijn er weinig laboratoria waar het monster op locatie wordt afgenomen en geanalyseerd en worden monsters in principe opgestuurd. Daarvoor wordt gebruik gemaakt van verschillende vervoersdiensten, zoals de post of koeriersdiensten.

De hoeveelheid reistijd wordt mogelijk beïnvloed door verschillende factoren, zoals afstand, type transport, het weekend of seizoensdrukte. Vooral voor transport uit het buitenland kan de reistijd behoorlijk oplopen.

Transport heeft ook invloed op de kosten. In de regel geldt dat hoe sneller ergens iets moet zijn, des te duurder het vervoer wordt. Vooral als het monster onder speciale omstandigheden vervoerd moet worden.
Daarnaast verschillen de voorwaarden voor het (optimale) vervoer per analysetechniek. Over het algemeen maken laboratoria gespecialiseerd in microbioom-onderzoek gebruik van vier methoden: Selectieve kweek, PCR, NGS en FISH. Hieronder een uitleg per analysemethode.

Analysemethode: Kweek

Het normale darmmicrobioom bestaat voor het overgrote deel uit anaerobe bacteriën. Normale afnameprocedures vinden plaats onder aerobe condities. Dit heeft groot effect op de aantallen en kweekbaarheid van grote aantallen darmbacteriën. Naast het diagnostisch probleem wat dit effect oplevert wordt dit tevens onderkend als een beperkende factor in fecestransplantaties[3].

Ontlastingsmonsters die gekweekt worden moeten gekoeld worden tijdens transport. Dit maakt het transport complexer. Zo niet, dan zullen diverse bacteriefamilies tijdens transport in kweekbare aantallen afnemen (voor zover die überhaupt kweekbaar zijn) en andere juist in aantallen gaan toenemen. Dit laatste treedt met name op bij transport onder warme omstandigheden. Het gevolg hiervan is een testresultaat dat niet overeenkomt met de oorspronkelijke situatie in het monster, met gevolgen voor de betrouwbaarheid en diagnostische relevantie van het onderzoek.

Ontlastingsmonsters die via selectieve kweek worden onderzocht moeten binnen 1 tot maximaal 3 dagen worden verwerkt door het laboratorium [4].

Analysemethode: PCR en NGS

Ontlastingsmonsters die met PCR-gebaseerde methoden worden geanalyseerd (PCR en NGS) hebben te lijden onder DNA-polymerase inhibitors, die altijd aanwezig zijn in feces. Dit zijn diverse soorten stoffen (meestal eiwitten) die van nature in de darm voorkomen en die de ‘motor’ van de PCR-reactie (i.e. het enzym DNA-polymerase) remmen in zijn functie.

Naast de invloed van DNA-polymerase ontstaan er afwijkingen als gevolg van de eerste analytische bewerking van een PCR-analyse: de isolatie van het te testen DNA uit het ontlastingsmonster [5,6]. Voor Next Generation Sequencing (waar PCR een integraal onderdeel van is) is de situatie niet veel beter. Ook hier zullen onder normale omstandigheden de meetresultaten al snel onbetrouwbaar worden [7,8].

Het gevolg hiervan is dat de testresultaten op basis van PCR-gebaseerde methoden met terughoudendheid geïnterpreteerd dienen te worden. Monsters voor PCR en NGS dienen binnen 3 tot 4 dagen door het laboratorium te worden verwerkt.

Een veelgebruikte oplossing is het gebruik van een conserveringsvloeistof (fixatief), maar dat heeft weer als nadeel dat het een extra stap bij het maken van het monster is, waarbij gemakkelijk fouten kunnen optreden. Daarnaast zijn de verhoudingen niet ideaal tussen fixatief en monster en is goede menging erg lastig. De effectiviteit van deze middelen (in het bijzonder RNAse inhibitors) bij darmmicrobioom-onderzoek is dan ook nog niet overtuigend aangetoond [9].

Analysemethode: FISH

Monsters die met de FISH-methode worden geanalyseerd zijn pas onbruikbaar als de celwandstructuur van de microbioombacteriën en hun ribosomale celinhoud is aangetast. FISH is immers een microscopische methode en daar zijn intacte bacteriën voor nodig. Nu is de bacteriële celwand opgebouwd uit peptiopglycan en dit is een stevig biopolymeer. Bacteriecellen blijven structureel dus lang intact en analyseerbaar middels FISH-gebaseerde methoden. Wij hebben bij NL-Lab uitgebreid getest hoe lang dit proces kan duren.

Monsters voor FISH zijn tenminste 7 dagen houdbaar en kunnen dan nog betrouwbaar onderzocht worden.

Overzicht houdbaarheid fecesmonsters

Overzicht houdbaarheid fecesmonsters afhankelijk van de analysetechniek.
Analysemethode: Kweek; 1-3 dagen houdbaarheid . Mits gekoeld, anders bacteriële afsterving en overgroei tijdens transport.
Analysemethode: Polymerase Chain Reaction; 3-4 dagenspatiehoudbaarheid. Na deze tijd exponentiële toename DNA-polymerase inhibitors in het sample.
Analysemethode: Next Generation Sequencing; 3-4 dagenspatiehoudbaarheid. Na deze tijd exponentiele toename DNA-polymerase inhibitors in het sample.
Analysemethode: Fluorescence in situ Hybridisation; 7 dagen houdbaarheid. Beste score qua houdbaarheid maar ook qua analytische dekkingsgraad.

Overige voordelen FISH-methode

Het mag duidelijk zijn dat de FISH-methode superieur is qua houdbaarheid van het monster. Maar er zijn meer voordelen: FISH biedt ook een veel hogere analytische dekkingsgraad (96% van het microbioom) en kan als enige de microbiologische activiteit van bacteriegroepen meten.
De gepatenteerde en geautomatiseerde C-FISH methode van NL-Lab zorgt dat deze superieure methode nu ook betaalbaar geworden is voor complexe analyses zoals darmmicrobioom-onderzoek.

Interesse of vragen?

Heeft u interesse in het darmmicrobioom-onderzoek van NL-Lab of heeft u vragen naar aanleiding van dit artikel, dan raden we u van harte aan contact met NL-Lab op te nemen.

Dr. Gijsbert J. Jansen, medisch bioloog

Diverse soorten onderzoeken kunt u hier bestellen.

Commentaar NDN redactie: opsturen testmonsters
Er zijn laboratoria die met een PCR en NGS analysemethode wel strikte regels hanteren in het versturen van ontlastingmonsters. Zie voorbeeld Medivere (geaccrediteerde partnerlaboratorium GANZIMMUN DIAGNOSTICS AG); FAQ (blokje diverse vragen betreffende opsturen van ontlasting monster).